Práctica 10. Bacilos gram negativos. Pruebas bioquímicas

OBJETIVOS

  •  El objetivo de esta práctica es realizar las pruebas bioquímicas para identificar bacilos gram negativos.

FUNDAMENTOS 

  • Dada la variedad de especies existentes, es preciso tener en cuenta el origen de la muestra, la etiología posible y los medios de cultivo empleados en su aislamiento. En principio pueden distinguirse:  
    • Microorganismos que crecen en medios no enriquecidos y en medios propios para enterobacterias, que pueden pertenecer al grupo de las enterobacterias o al grupo de los no fermentadores de azúcares. Son bacterias que se aíslan muy frecuentemente en laboratorios clínicos.  
    • Otras bacterias, que se aíslan sólo como resultado de una búsqueda específica, utilizando medios especiales; entre ellas podemos citar a Vibrio y Campylobacter, y por otra parte los microorganismos nutricionalmente exigentes como Haemophilus, Brucella, Bordetella y Legionella.  
  • La identificación de bacilos G(-) puede iniciarse con la prueba de oxidasa y la oxidación/fermentación de glucosa (O/F).

MATERIALES
Papel de filtro
Mechero Bunsen
Asa de siembra
Portaobjetos



REACTIVOS
Reactivo prueba oxidasa

MICROORGANISMOS
Proteus


PROCEDIMIENTO

  • KLIGER

  1. Se siembra una colonia, con el hilo de platino, en picadura en el fondo del tubo.
  2. Se siembra en estría sobre la superficie del pico de flauta.
  3. Se incuba a 37ºC durante 24 horas.
  4. Resultado:

  • INVIC

  • INDOL 
  1. Se prepara un caldo de peptona o triptona.  
  2. Se inocula una colonia de la muestra en el tubo con el medio de cultivo.
  3. Se incuba a 37ºC / 24- 48 h.  
  4. Se añaden varias gotas de reactivo de Kovacs que al ser menos denso que el caldo de peptona o triptona queda sobre la superficie de éste formando una especie de anillo:  
    1. Si este anillo es de color rojo-morado la reacción es positiva.  
    2. Si este anillo es de coloramarillo (reactivo de Kovacs), la reacción es negativa.
  • ROJO DE METILO
  1. Se prepara el medio líquido de Clark-Lubs, se envasa en tubos y se esteriliza en el autoclave.
  2. Se inoculan las colonias bacterianas en el medio líquido, se incuban a 37ºC / 24 – 48 horas.
  3.  Se añaden varias gotas de solución alcoholica de rojo de metilo al 0 ́04%.  
  4. Resultados:
    1.  La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable.

  • VOGES-PROSKAUER
  1. Se inoculan las colonias bacterianas en el medio líquido.
  2. Se incuban a 37ºC / 24 – 48 horas.
  3. Al hacer la lectura se añade, al tubo que contiene el medio de Clark-Lubs, unas gotas (0 ́6 ml) de solución de alfa-naftol, agitar y añadir KOH al 40% (0.2 ml). 
  4. Agitar y observar a los 15 min.  
  5. Resultado: La prueba VP es positiva si, pasados 15 min, se desarrolla un color rojo-fucsia que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína
  • CITRATO
  1. Se siembra, con asa de platino, en la superficie inclinada de un tubo con "agar citrato de Simmons".
  2. Se incuban los tubos durante 24 horas a 37ºC y se hace la lectura del test.  
  3. Resultados: 
    1.  La reacción es citrato positiva cuando se producen un cambio de color del medio (verde) a azul.
    2.  La ausencia de cambio de color (verde) se considera un resultado negativo

  • TEST DE LA UREA

  1. Se siembra una gran cantidad de bacterias en el tubo que contiene urea.
  2. Se incuban los tubos a 37ºC.
  3. No observamos ningún cambio ya que este medio no se encontraba en buen estado.
RESULTADOS

REACTIVOS UTILIZADOS PARA LAS LECTURAS



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