Práctica 9. Cocos gram negativos. Pruebas bioquímicas 13/12/2019

OBJETIVOS

•  El objetivo de esta práctica es aplicar las técnicas aprendidas sobre las pruebas bioquímicas para identificar cocos gram negativos.

FUNDAMENTOS

• Oxidasa. Se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos, aerobios o anaerobios facultativos, de producir el enzima “citocromo oxidasa”, que cataliza, en la cadena respiratoria, la transferencia de electrones desde un sustrato orgánico hasta el oxigeno. Para poner de manifiesto la producción de este enzima se utiliza, como indicador, un compuesto (Tetrametil- p -fenilen diamina o reactivo de Kovacs) que se oxida en presencia de citocromo oxidasa transformándose en un producto coloreado.
• Fermentación de azúcares. A menudo las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas fermentan los carbohidratos produciendo ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2) los cuales pueden detectarse mediante un indicador de pH y una campana Durham.
• ONPG. En esta prueba se determina la capacidad que presentan algunas bacterias, que poseen el enzima β- galactosidasa, para fermentar la lactosa originando glucosa y galactosa. Para realizar la prueba se añade un sustrato artificial, ortonitrofenil galactósido (ONPG), que al ser hidrolizado por la β-galactosidasa origina un compuesto (orto- nitrofenol) de color amarillo.
  

MATERIALES

Tubos

Papel de filtro

Pinzas

Mechero Bunsen

Asa de siembra

Portaobjetos

REACTIVOS

Discos ONPG

SSF

Reactivo para prueba fermentación de azúcares

Reactivo de Kovacs

MICROORGANISMOS

kLEBSIELLA

E. Coli

PROCEDIMIENTO

• OXIDASA

1. Colocamos un trozo de papel de filtro sobre un portaobjetos.
2. Agregamos 3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
   
3. Extendemos una colonia, con el asa de siempre, sobre el papel impregnado.
   
4. Reacción positiva, ya que se observa la aparición de color violeta.
   

• FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

1. Inoculamos el microorganismo en un medio líquido que contenga una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable.
   
2. Colocamos dentro de los tubos una campana Durham.
   
3. Incubamos durante 24 horas a 37ºC.
4. Al pasar las 24 horas, no notamos ningún cambio. Puede deberse a que los discos estuvieran caducados.
   

• ONPG

1. Depositamos 1 ml de solución salina estéril en un tubo de ensayo.
2. Con unas pinzas estériles, depositamos un disco de ONPG en el tubo.
   
3. Con el asa de platino, inoculamos una colonia en el tubo.
4. Incubamos 24 horas a 37ºC.
5. Resultado negativo, se encontraba igual.